При качественном определении способности микроорганизмов синтезировать'витамин В^ можно ограничиться выяснением их способности давать зоны роста тест-организма. В этом случае вместо расстановки цилиндриков на агар можно делать пробочным сверлом колодцы в агаре и в них закапывать испытуемый гидролизат. По величине зон в сравнении с величиной зоны, полученной от стандартного раствора В12, можно приблизительно судить о биосинтетической активности данного микроорганизма
(рис. 22).
Изучаемые микроорганизмы выращивают в жидкой питательной среде, разлитой в колбочки емкостью 250 мл, по 50 мл в каждую. Для эпифитных микроорганизмов можно использовать капустную среду № 19. Выращивание ведут в течение 10 суток. Полученную культуральную жидкость подкисляют 2 н. НС1 до рН 1,0 по индикатору тимолблау. Индикатор не приливают к испытуемой жидкости, а определяют рН в отобранных пробах.
Для приготовления 2 н. НС1 берут 73 г концентрированной НС1 (уд. вес 1,09) и доводят водой объем до 1 л. Для приготовления индикатора тимолблау навеску вещества 0,04 г растворяют в 100 мл спирта. Раствор имеет красный цвет, который в кислой среде изменяется до желтого.
Подкисленную культуральную жидкость объемом 120 мл разливают тонким слоем в чашки Петри и выпаривают в сушильном шкафу при 40° до 20 мл. Для получения вытяжек гетероауксина к раствору после' его выпаривания (20 мл) приливают 30 мл серного эфира и встряхивают в течение 4 часов на качалке в темноте. После этого жидкость отстаивают 12 часов на холоду; отстой эфира сливают, а в жидкость снова добавляют 30 мл эфира и повторяют тем же способом получение вытяжки и отстоя, т. е. снова встряхивают 4 часа, отстаивают в холодильнике 12 часов и сливают отстой.
Эфирную вытяжку (60 мл) разливают в фарфоровые чашки и ставят в вытяжной шкаф для испарения. По мере уменьшения объема жидкость сливают в одну маленькую фарфоровую чашку (диаметром 3 см), высушивают до получения сухого остатка, к нему приливают 0,1 мл воды, растирают стеклянной палочкой и наносят по 20 капель петлей (0,01 мл) на точку старта на хроматографическую бумагу. Бумагу берут сорта Ленинградская медленная и нарезают ее полосами 3,5X20,0 см.
Хроматограммы делают восходящие, т. е. полоски бумаги подвешивают на вешалку, а нижний конец опускают в чашечку с растворителем. Все накрывают стеклянным колпаком. Растворителем служит смесь п-бутилового спирта, аммиака и воды, взятых в соотношениях 40: 10:50; их смешивают в делительной воронке и для разгонки используют только верхний, отстоявшийся слой. Хроматограммы разгоняют до тех пор, пока жидкость не поднимется по бумаге до самого верха, на что потребуется 2 дня. После этого бумагу снимают, сушат в вытяжном шкафу при комнатной температуре и проявляют, обрызгивая ее из пульверизатора проявителем так, чтобы она стала сырой. Проявителем служит смесь 5%-ной хлорной кислоты (НС104) и 0,05 М хлорного железа FeCl3 (рыжего цвета) в соотношении 50: 1 (100 мл 5%-ной НС104 + 2 мл 0,05 М FeCl3).
Для приготовления 5%-ной НСЮ4 нужно взять 56 мл продажного НС104 с удельным весом 1,54 и довести до 1 л водой. 0,05-молярный раствор хлорного железа получают разведением 8,125 г FeCl3 в 1 л воды.