Приготовление шкал с витаминами заключается в том, что в стерильные пробирки, которых берут по три, параллельные для каждого разведения, наливают точно по 2 мл среды Ридер (без испытуемого витамина). В 3 пробирки первого ряда наливают по 2 мл среды двойной концентрации, а в остальные — обычной. Пробирки подписывают (карандашом «стеклограф»), указывая по порядку номера, соответствующие известным количествам микрограммов витамина, содержащимся в каждой из них. В первый ряд пробирок добавляют по 2 мл рабочего раствора витамина, при этом получается его разведение средой в 2 раза. После тщательного перемешивания содержимого каждой пробирки пипеткой из них берут по 2 мл жидкости и переносят в пробирки следующего ряда, опять перемешивают и вновь переносят по 2 мл. Так делают ряд последовательных разведений, в каждом из которых содержится витамина в 2 раза меньше, чем в предыдущем. Для того чтобы во всех пробирках был одинаковый объем жидкости (2 мл), из последних пробирок выливают по 2 мл лишних.
Схема расстановки пробирок для приготовления разведений при определении количества витаминов приведена на
рис. 21.
Пробирки с приготовленными разведениями витамина стерилизуют в автоклаве 10 минут при 0,5 атм. В простерилизованные пробирки вносят по 1—2 капли 2-суточной суспензии тест-культуры, предварительно пассированной несколько раз на жидкой среде Ридер, не содержащей изучаемого витамина.
Рост тест-культуры перед ее использованием должен быть очень скудным, в виде слабого помутнения среды. Засеянные пробирки помещают в термостат при 28°.
Шкалы готовят для каждого опыта отдельно, так как он должен ставиться в абсолютно тождественных условиях параллельно с исследуемым материалом.
Порядок определения. Для работы используют пробирки, вымытые хромпиком, высушенные, закрытые ватными пробками и простерилизованные. Их расставляют в штативы так же, как и при приготовлении шкалы: по 7 рядов для каждого испытуемого образца, по 3 параллельных в каждом ряду.
Рис. 20. Кривая определения количества никотиновой кислоты.
Следует помнить, что для определения различных витаминов используют не одну и ту же среду Ридер. В каждом случае при добавлении набора витаминов исключают определяемый, а в некоторых случаях все, например при определении инозита, тиамина, биотина и других, как указано выше, В соответствии с потребностями в витаминах каждого теста.
Испытуемый материал (автолизат бактериальных клеток, культуральная жидкость или ее фугат, питательные среды и др.) разводят водой 1 : 10. Для клеток учитывают разведение, полученное при приготовлении автолизата. Это исходное разведение вносят в 3 пробирки первого ряда, по 2 мл в каждую.
На пробирках надписывают номер испытуемого образца, название определяемого витамина и порядковый номер разведения, начиная с 1-го, соответствующего разведению 1 :20 или больше, в зависимости от цели исследования, и кончая 7-м. После этого делают разведения так же, как при приготовлении стандартной шкалы; затем пробирки стерилизуют и засевают тест-культурой, как описано выше. Скорость роста тест-культур неодинакова, поэтому засеянные пробирки оставляют в термостате на разные промежутки времени: например, при определении В6 с Saccharomycodes Ludwigii — на 40 часов, В6 с Zigosaccharomyces disporus D. — на 24 часа, РР с Zigosaccharomyces 737 — на 24 часа. В3 с Saccharo-myces cerevisea—на 24 часа, биотина (В7) с Saccharo-myces ellipsoideus — на 96 часов, инозита (В8) с Saccha-romyces carlsbergensis
Рис. 21. Схема расстановки пробирок для приготовления разведений при определении количества витаминов.