Сущность методов. Определить способность микроорганизмов к биосинтезу витаминов группы В, так же как и их содержание в других объектах, можно качественным (чашечным) и количественным (с использованием жидкой питательной среды) методами. Оба метода основаны на учете интенсивности роста индикаторных организмов (тест-культур), которая зависит от количества витаминов, содержащихся в среде.
В настоящее время методом селекции отобраны специальные дрожжеподобные культуры, каждая из которых чрезвычайно чувствительна к содержанию в среде определенного витамина (Е. Н. Одинцова, 1959). Эти культуры следующие: Debaryomyces disporus Dekker — используется для определения тиамина (Bi) и пиридоксина (В6); Saccharomycodes Ludwigii К. М. — для пиридоксина и для пантотеновой кислоты (В3); Saccharomy-ces cerevisea Ленинградская — также для пантотеновой кислоты и для р-аланина; Zigofabospora marxiana 734, Zigosaccharomyces 737 и Saccharomyces fragilis — для никотиновой кислоты (РР); Rhodotorula sp. № 45 — для фолиевой (Вэ) и парааминобензойной (Вю) кислот; Saco-haromyces carlsbergensis или Torulopsis dattila 375 — инозита (B8); Zigosaccharomyces bisporus Dekker, Saccharomyces ellipsoideus или Candida trOpicalis CK-4 — для биотина (B7) и некоторые другие.
Индикаторные культуры хранятся на сусло-агаре.
Фосфаты добавляют в виде раствора в последнюю очередь, чтобы избежать помутнения среды.
Стерилизуют в автоклаве 20 минут при давлении 0,5 атм. К среде Ридер добавляют набор витаминов, за исключением одного определяемого, в следующих количествах: инозит — 5,00 мг на 1 л, Bi — 1,00, В6 — 0,25, В3 —0,25, РР —0,25, биотин —0,002 мг на 1 л.
При определении витамина В6 вместо витаминов можно добавлять специально приготовленный автолизат дрожжей, который готовят по методу М. Н. Мейселя и и Н. А. Помошниковой (1952). Разводку из 500 г дрожжей в 500 мл воды, кипяченной и остуженной до 60°, выдерживают при 45—50° 3—4 дня. Осадок промывают 250 мл воды и обе жидкости соединяют, фильтруют, нейтрализуют до рН 6,8. Автоклавируют 30 минут при 105°. Этот автолизат разводят водой до концентрации 10%, доводят рН до 7,0; разливают в чашки Петри по 10 мл и облучают 4 часа на расстояний 25 см ртутно-кварцевой лампой ПРК-2. Испаряющуюся воду добавляют.
После облучения в автолизате разрушается пиридоксия (В6), а все остальные витамины сохраняются.
Для определения количества витамина готовят среду Ридер и добавляют в нее автолизат 1—2% (10—20 мл на 1 л).
В некоторых случаях, особенно при качественном определении витаминов Bi и биотина при использовании указанных выше тестов, а также инозита с тест культурой Т. dattila 375, можно пользоваться средой Ридер без добавления к ней витаминов.
В клетках тест культур, хранящихся на сусло-агаре, обычно накапливается некоторое количество витаминов. Поэтому необходимо перед употреблением индикаторные культуры несколько раз (2—5 раз) пассировать на среде Ридер (агаровой или жидкой), не содержащей определяемого витамина.
Вся посуда для приготовления питательных сред и воды — чашки Петри, пробирки, пипетки, колбы — должна быть тщательно промыта хромовой смесью и прополоскана дистиллированной водой.